寻找能调控植物的生长发育、形态结构和代谢产物的功能基因一直是药用植物研究的重点，但选择适合的方法验证基因功能验证也是伴随着困扰广大研究者的问题。大部分研究利用拟南芥、烟草等模式植物做异源表达来验证基因功能。但是，许多药用植物含有自身独特的次生代谢产物，而拟兰芥、烟草等模式植物在进化途径和遗传背景上与之存在显著差异，这可能导致研究者对基因的功能不全面甚至错误的认识。因此，每种药用植物建立一个自身专属、稳定且有效的基因功能验证体系是十分迫切的。瞬时表达体系具有简单、快速、准确的优点，十分适合应用于非模式植物的基因功能验证。

近日，威尼斯98488药学院/现代中药产业学院、西南特色中药资源国家重点实验室裴瑾教授团队在国际知名期刊BMC plant biology（中科院分区2区）发表题为The establishment of transient expression systems and their application for gene function analysis of favonoid biosynthesis in Carthamus tinctorius L.的论文，博士研究生鲜彬为第一作者，裴瑾教授和陈江副教授为通讯作者，西南特色中药资源国家重点实验室为第一单位。该论文以药用植物红花的愈伤组织为材料，分别建立了农杆菌和基因枪瞬时表达体系，并用于基因功能的验证。

红花 Carthamus tinctorius L.为菊科红花属一年生草本植物，以不带子房的干燥管状花入药。红花中含有许多黄酮类化合物，其中羟基红花黄色素A（HSYA）、脱水红花黄色素B（Anhydrosafflor yellow B）、红花红色素（Carthamine）等是红花独有的一类成分，也是影响红花品质的重要化学指标。为解析红花品质形成相关机制，许多黄酮合成的相关基因被筛选克隆，但红花中缺乏成熟的表达体系验证基因功能，大多数候选基因尚未进行体内功能验证。体内基因功能验证常用方法包括稳定遗传转化和瞬时遗传转化，瞬时表达体系更加便捷、快速，适合应用于非模式植物基因功能研究。农杆菌和基因枪是瞬时表达体系中常用的介导方法，愈伤组织是瞬时表达的常用材料之一。为在红花中建立黄酮合成相关基因功能研究的方法体系，该研究首次利用农杆菌和基因枪转化法对红花愈伤组织进行转化，利用功能已知的基因对瞬时表达体系进行了验证。

研究以红花无菌苗子叶为外植体，诱导出了淡黄、质地疏松的愈伤组织。对红花愈伤组织成分进行测定，从愈伤组织中检测出了多种黄酮类化合物，表明红花愈伤组织具有作为瞬时表达材料的物质基础。

图1 红花愈伤组织诱导结果

研究使用载体带有 GUS 标签。建立农杆菌瞬时表达体系时，实验考察了菌液状态、菌液浓度和浸染时间等条件。转化后的愈伤组织能被染为蓝色，表明农杆菌能有效转化红花愈伤组织，进一步通过单因素实验得出了农杆菌转化红花愈伤组织的最佳实验条件。建立基因枪瞬时表达体系时，实验考察了氦气压力、真空度和轰击距离等实验条件；实验发现轰击后的愈伤组织用被成功转化，并得到最佳转化条件。

图2 不同参数条件下的瞬时转化效率

初步建立两种瞬时表达体系后，实验通过过表达红花中功能已知的基因来验证体系的有效性。结果发现该基因的相对表达量显著升高，黄酮类化合物含量也发生改变，证明了该体系的能够用于基因功能的验证。

图3 CtCHS瞬时表达结果

综上，研究建立了农杆菌和基因枪介导的红花愈伤组织瞬时表达体系，并验证了两种表达体系的有效性。为后续验证红花黄酮合成基因的功能提供了方法基础，也为其他药用植物基因功能研究提供思路。

该成果得到国家自然科学基金：川产道地药材的道地性研究(No.U19A2010)；四川省“十四五”农作物及畜禽育种攻关项目：突破性道地中药材育种材料和方法创新及新品种选育——红花(No.2021YFYZ0012-5)和国家中医药多学科交叉创新团队项目：西南特色中药资源多维评价多学科交叉创新团队(No.ZYYCXTD-D-202209)基金项目的支持。

全文链接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37032332/

供稿：西南特色中药资源国家重点实验室、药学院/现代中药产业学院裴瑾教授课题组。